蛋白質(zhì)測(cè)定常用的方法是凱氏定氮法，它是通過測(cè)定氮含量從而換算成蛋白質(zhì)的方法，是上通用的標(biāo)準(zhǔn)方法，其優(yōu)點(diǎn)為實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單、方便，測(cè)量結(jié)果的重復(fù)性和重現(xiàn)性好，而被廣泛應(yīng)用于各類食品、谷物、飼料等樣品的蛋白質(zhì)含量測(cè)定中。凱氏定氮法分為常量、半微量、微量法三種方法，其原理是食品中的蛋白質(zhì)在催化加熱條件下被分解，產(chǎn)生的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨。堿化蒸餾使氨游離，用硼酸吸收后以硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液滴定，根據(jù)酸的消耗量乘以換算系數(shù)，即為蛋白質(zhì)的含量。該方法有取樣、樣品消化、蒸餾、滴定四個(gè)步驟，其原理較為復(fù)雜，使用的試劑也比較多，以下將對(duì)這四個(gè)步驟進(jìn)行簡(jiǎn)單講述。
1、樣品的取樣
取樣應(yīng)具有代表性，取樣前將樣品充分混勻，固體試樣可用粉碎設(shè)備制成細(xì)小均勻粉末。稱量放入凱氏定氮瓶時(shí)，切勿使樣品粘附在瓶頸部，避免樣品未消化而造成氮損失。
2、樣品的消化
樣品中含氮有機(jī)化合物經(jīng)硫酸在加熱的條件下消化，硫酸的作用促使有機(jī)物脫水炭化。含氮的有機(jī)物炭化并生成碳，碳在將硫酸還原為二氧化硫的反應(yīng)中，自身則被氧化成為二氧化碳；反應(yīng)過程中產(chǎn)生的二氧化硫?qū)⒌€原為氨氣，此過程中其自身則被氧化成三氧化硫；而消化過程生成的氫，又加速了氨的形成。生成的水以水蒸氣的形式連同反應(yīng)過程中生成的三氧化硫一同逸出，而氨氣則以硫酸銨的形式留在消化液中。
化學(xué)反應(yīng)方程式為：
2NH2（CH2）2COOH＋13H2SO4→（NH4）2SO4＋CO2↑＋SO2↑＋16H2O
此過程的注意事項(xiàng)：①樣品消化時(shí)，對(duì)于含糖量很高或含脂量較多的樣品，應(yīng)注意要緩慢升溫加熱，并隨時(shí)注意控制加熱的溫度，避免產(chǎn)生大量泡沫噴出或噴濺到瓶壁上，造成樣品的損失。若因加熱溫度不當(dāng)，局部溫度過高使消化液噴濺到瓶壁上，應(yīng)及時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)凱氏定氮瓶將濺到瓶壁上的樣品消化液沖下，也可在樣品消化前加入少量辛醇或液體石蠟，以減少泡沫的產(chǎn)生。②消化時(shí)應(yīng)不定時(shí)旋轉(zhuǎn)凱氏定氮瓶，將附在瓶壁上的碳粒沖下，使樣品充分消化。③若樣品難以消化至澄清透明的程度，可將凱氏定氮瓶從加熱器上取下，待其中溶液冷卻至室溫后，向消化液中加入少量過氧化氫，再繼續(xù)加熱直至消化。④整個(gè)消化過程中硫酸的量要充足，以保證樣品中含氮有機(jī)化合物的消化。樣品中脂肪含量過高時(shí)，要增加硫酸的量，因消化時(shí)脂肪消耗硫酸的量較大，使硫酸缺少而影響測(cè)定。⑤在樣品消化末期，即消化液呈藍(lán)綠色并澄清透明后，再繼續(xù)加熱半小時(shí)即可，因此時(shí)瓶?jī)?nèi)消化液溫度過高，若長(zhǎng)時(shí)間加熱，會(huì)使生成的硫酸氫銨分解并釋放出
氨氣，使氮的含量損失，從而影響測(cè)定結(jié)果。
3、蒸餾
化學(xué)反應(yīng)方程式為：
?。∟H4）2SO4＋NaOH→Na2SO4＋NH3↑＋H2O
注意事項(xiàng)：①水蒸氣發(fā)生器中的水要呈酸性，因水中可能含有微量的氨離子，防止其受熱溢出而影響測(cè)定結(jié)果。②蒸餾反應(yīng)過程中，硫酸銨為強(qiáng)酸弱堿鹽，可使消化液為弱酸性溶液。為保證測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確性，務(wù)必使結(jié)合態(tài)的氨能反應(yīng)并釋放出來，因此整個(gè)蒸餾過程中，堿液的量不足，酸堿中和反應(yīng)則不，很難達(dá)到使氨充分分離的目的，從而使測(cè)量結(jié)果不準(zhǔn)確。氫氧化鈉溶液既能中和樣品消化液中過量的酸，又可為氨的有效分離提供一個(gè)堿性環(huán)境，因此氫氧化鈉的用量要控制適當(dāng)。實(shí)驗(yàn)者可利用消化液中含有的銅離子，根據(jù)其特征顏色作為堿性反應(yīng)的指示劑。當(dāng)反應(yīng)室內(nèi)加入氫氧化鈉溶液后，其溶液顏色立即變?yōu)樗{(lán)黑色時(shí)，表明氫氧化鈉已過量，能達(dá)到酸堿反應(yīng)的要求，可保證反應(yīng)進(jìn)行。③加氫氧化鈉的漏斗要采用水封，避免因蒸餾裝置漏氣造成氨的溢出而影響測(cè)定結(jié)果。
4、滴定
氨以氣體的形式被釋放出來，用硼酸溶液吸收后，使用鹽酸或硫酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液進(jìn)行酸堿滴定，從而計(jì)算出樣品中蛋白質(zhì)的含量。此過程的注意事項(xiàng)：①硼酸吸收液的溫度不宜過高，過高則氨的吸收能力將減弱，會(huì)影響測(cè)量結(jié)果，使結(jié)果偏低。方式是保持溶液溫度在20℃以下，或?qū)⒔邮掌恐糜诶渌≈?。②硼酸吸收液的體積不使用精密量取，只要保證能將氨全部吸收即可，因?yàn)榕鹚岬乃嵝院苋?，不?huì)影響滴定。③滴定用的標(biāo)準(zhǔn)滴定液必須按照要求進(jìn)行配制和標(biāo)定，因其準(zhǔn)確度直接影響測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確性。④計(jì)算蛋白質(zhì)的含量時(shí)須乘以氮換算蛋白質(zhì)的系數(shù)，一般食物為6。25。
5、小結(jié)
新鮮食品中的含氮化合物大都以蛋白質(zhì)為主體，所以檢驗(yàn)食品中的蛋白質(zhì)含量時(shí)，只限于測(cè)定總氮量，然后乘以蛋白質(zhì)換算系數(shù)6。25，即可得到蛋白質(zhì)含量。凱氏定氮法可用于所有動(dòng)、植物食品的蛋白質(zhì)含量測(cè)定，因樣品中常含有核酸、生物堿等以及含氮色素等非蛋白質(zhì)的含氮化合物，所以該法測(cè)定結(jié)果為粗蛋白質(zhì)含量。筆者通過參加國家機(jī)構(gòu)組織的“食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定”能力檢驗(yàn)證，以反復(fù)實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)，在實(shí)驗(yàn)過程中摸索可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的關(guān)鍵點(diǎn)和注意事項(xiàng)，嚴(yán)格把握實(shí)驗(yàn)原理，多次推敲與總結(jié)，得到上述實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)。
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